Исследование деяких фізико-хімічних властивостей протеиназы Penicillium wortmannii

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Химия


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Глава 1. Огляд литературы

1.1 Протеиназы мікробного происхождения
1.2 Ферменти, їх фізико-хімічні свойства
1.3 Виділення очищення препаратів протеиназы
1.4 Розщеплення коллагенсодержащего сировини й його применение

Глава 2. Матеріали й методи исследования

2.1 Визначення рН
2.2 Визначення протеолитической активности
2.3 Визначення коллагеназной активности
2.4 Визначення молекулярної массы
2.5 Визначення змісту аминного азота
2.6 Электрофоретические исследования
2.6.1 Визначення гомогенності очищенных
2.6.2 Ідентифікація протеиназ в ПААГ

Глава 3. Одержання препаратів протеиназы Penicillium wortmannii 2091
як дослідження їх фізико-хімічних свойств

3.1 Розробка умов виділення препарата
Penicillium wortmannii BKMF 2091

3.2 Фракціонування протеолитического комплексного
препарату ферментов
3.3 Вплив температури і рН на активність фермента
3.4 Визначення молекулярної массы
3.5 Дослідження процесів кислотною та термічним инактивации
3.6 Вплив іонів металів і інгібіторів на активний центр фермента
3.7 Субстратная специфичность
3.8 Гідроліз коллагенсодержащего сировини: ноги птахів, шквара

Глава 4. Методична часть

4.1 Межпредметность — сучасний принцип обучения
4.2 Межпредметные зв’язку під час уроків хімії
4.3 Методичні рекомендації щодо реалізації принципов
межпредметных зв’язків щодо тим, связанных
з визначенням «ферментні препараты

Выводы
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ.

Найважливішим властивістю низки білків був частиною їхнього каталитическая активність. Речовини білкової природи, здатні каталитически прискорювати хімічні реакції, називають ферментами. Роль ферментів в життєдіяльності тварин, рослин i мікроорганізмів колосальна. Нині в біологічних об'єктах виявлено кілька тисяч індивідуальних ферментів, а кілька сотень їх виділено і изучено.
Біологічні каталізатори за низкою ознак суттєво різняться від неорганічних каталізаторів. Будучи білками, ферменти мають усіма їх властивостями. Сюди відносяться термолабильность ферментів, залежність їхні діяння від значення рН середовища, специфічність, схильність впливу активаторів і ингибиторов.
Термолабильность ферментів пояснюється лише тим, що температура, з одного боку, впливає на білкову частина ферменту, наводячи при занадто високому значенні до денатурації білка та зниження каталітичної функції, з другого боку, впливає на швидкість реакції освіти фермент-субстратного комплексу, й попри всі наступні етапи перетворення субстрат. З іншого боку, кожному за ферменту існує оптимальне значення рН середовища, коли виявляє максимальну активність. Більшість ферментів має максимальну активність у зоні рН неподалік нейтральній точки. Специфічність — одне з найбільш видатних властивостей ферментів. Дане властивість ферментів пояснюється першу чергу збігом просторових конфігурацій субстрату і субстратного центру ферменту. Ферменти може бути абсолютної, відносної, стереохимической специфічністю. Вплив на ферменти активаторів і інгібіторів було вперше вивчено А. Я. Данилевским. Інгібітори гальмують дію ферментів. Механізм ингибирующего дії зводиться до двох типам гальмування (необоротне і оборотне). Оборотне ингибирование дії ферментів то, можливо конкурентним і неконкурентным.
Будучи виділено з організму, ферменти втрачають здібності здійснювати каталітичну функцію, тоді грунтується їх використання у різних галузях промисловості. У хлібопекарської промисловості застосовують ферментні препарати, які стосуються роду Aspergillus. У пивоварної і спиртової промисловості застосовують амилазы — ферменти, що прискорюють реакцію осахаривания крохмалю. У шкіряному і хутряному виробництві застосовують препарати протеиназ. Ферменти знаходять велике використання у медицині. Пепсин, трипсин, хімотрипсин, липазу і амилазу застосовують на лікування захворювань ШКТ. Протеолитические ферменти — плазмин і активуючі його стрептокиназу і урокиназу — для розчинення тромбів в кровоносних посудинах. З іншого боку, специфічну сферу застосування ферментів до медицини становить энзимодиагностика (захворювання то, можливо тестировано за рівнем змісту ферменту чи співвідношення його багатьох форм у крові чи рідше в моче).
ГЛАВА 1. ОГЛЯД ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Протеиназы мікробного происхождения.

Протеолитические ферменти синтезуються практично всі живими істотами. У промислових цілях як джерело протеиназ використовуються тварини тканини, рослин та клітини мікроорганізмів. Найперспективнішим джерелом протеиназ можна припустити мікроорганізми за низкою істотних переваг, пов’язаних, передусім, з неограниченностью джерел, можливістю широко варіювати властивості методами селекції та генної інженерії, добором умов біосинтезу, широкий спектр ферментних комплексів і глибиною на різні субстрати, а як і простотою і відносній дешевизною технологии.
Продуценти протеолітичних ферментів виявлено серед найбільш різних груп мікроорганізмів: бактерій (Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas), микромицетов (Aspergillus, Rhizopus, Penicillium), актиноміцетів (Streptomyces, Actinomyces). На основі в нас у країни й там створено великотоннажне виробництво ферментних препаратів протеолитического действия.
Багато широко распространённые мікроорганізми секретують значну кількість протеолітичних біокаталізаторів в довкілля, що полегшує завдання їх виділення, тож очищення. Можливість управління ферментів рахунок добору відповідної живильне середовище і умов культивування дозволяє як збільшити вихід протеолітичних ферментів, а й отримувати ферментні препарати з певними властивостями. Методи селекції та генної інженерії значно збільшують можливості цілеспрямованого біосинтезу ферментів. Істотною є здатність мікроорганізмів виробляти ферменти, унікальної своєї субстратной специфічності (кератиназы, коллагеназы, эластазы).
Значну увагу, яку приділяють вивченню протеолітичних ферментів мікроорганізмів, призвело до отриманню великої кількості препаратів бактеріальних і грибних протеиназ в высокоочищенном состоянии.
Нині до номенклатури і класифікацію ферментів внесено дуже багато протеолітичних ферментів мікробного походження, які належать до різним подклассам. За сучасною класифікації протеолитические ферменти ставляться до класу гидролаз й утворюють підклас пептид-гидролаз, чи протеаз. Протеази зазвичай поділяються на пептидазы і протеиназы. Проте чіткого поділу за цьому ознакою немає, оскільки встановлено, що протеиназы (пепсин, трипсин, папаин та інші) гидролизуют пептидные зв’язку у білках, а й різних полипептидах. Останніми роками значно змінилися ставлення до протеолітичних ферментах. Відповідно до класифікації Бергмана, підклас пептид-гидролаз ділиться на дві групи: эндопептидазы і экзопептидазы, які відрізняються специфічністю дії на субстрат. Эндопептидазы гидролизуют пептидные зв’язку, отщепляя послідовно кінцеві амінокислоти. Эндопептидазы можуть діяти на центральні ділянки пептидной зв’язку й розщеплювати молекулу білка більш дрібні фрагменти. Экзопептидазы що неспроможні гідролізувати пептидные зв’язку, перебувають у середині кайдани й посадили діють, отщепляя послідовно одну одною кінцеві аминокислоты.
Слід зазначити, що з протеолітичних ферментів мікробного походження одержані кристалічному вигляді, наприклад, субтилизин КФ 3.4. 21. 14, сериновая эндопептидаза Alternaria КФ 3.4. 21. 16, сериновая протеиназа Arthrobacter КФ 3.4. 21. 14, кисле протеиназа Aspergillus oryzae КФ 3.4. 23. 6, кисле протеиназа Penicillium janthinellum КФ 3.4. 26.6. та інші. Часто під номером дуже багато ферментів, отримуваних з різних джерел, але вже мають подібні свойства.
У промисловості найчастіше отримують комплекс протеолітичних ферментів, гідності якого визначаються з урахуванням аспектів наступного застосування ферментного препарату. Загальна протеолитическая активність препаратів визначається на стандартних субстратах (казеине, гемоглобіні, казеинате натрію) відповідно до відомими методами і використовується порівнювати ефективності їхні діяння на специфічні субстрати (колаген, эластин, кератин, желатин і т.д.).
Слід зазначити, що маємо країни проведено певні дослідження та узагальнення за паливною ефективністю мікробних протеиназ при розщепленні білків тварин тканин. Але тільки для деяких із них глибоко вивчені фізико-хімічні властивості, проведена ідентифікація функціональних груп каталітичного центру, досліджені кінетика гідролізу субстратів і субстратная специфічність, розшифровано первинна структура.
Виробництво протеолітичних препаратів організовано з урахуванням мікроскопічних грибів пологів Aspergillus і Rhizopus при поверхневому культивуванні продуцентів, і навіть з урахуванням бактерій Bacillus (subtilis, mesentericus, licheniformis, cereus та інших.) при глибинному культивировании.
Протеиназы, отримані з цих культур, мають високої активністю. Вони знаходять широке використання у різних галузях промисловості для гідролізу тварин і звинувачують рослинних білків. Серед мікроорганізмів — продуцентів протеиназ щонайменше важливе місце, ніж бактерії, займають актиномицеты Streptomyces (bradia, griseus, fradiospiralis). Вперше здатність синтезувати протеиназы актиномицетами було показано Ваксманом, та був Красильниковим. З того часу велика кількість робіт радянських і зарубіжних вчених присвячено вивченню протеолітичних ферментів актиноміцетів [6, 17]. Нині з’явилися роботи, де описано використання актиноміцетів як продуцентів кератиназы [24], эластазы [28], коллагеназы [26]. Проте промисловий випуск протеиназ з актиноміцетів розвинений слабко. Відомі лише препарати протеиназ Streptomyces griseus і Streptomyces fradie.
Проте проведення глибокі дослідження ферментів у мікроорганізмів ускладнюється високої гетерогенністю синтезованих протеолітичних комплексів, потребують особливо і чутливих методів виділення, тож очищення. Комплексні препарати, одержувані практично, дають специфічні ефекти при гідролізі субстратів. Приміром, протеолитические ферменти бактеріального і грибного походження діють у основному для білки м’язової тканини. Разом про те, відомі комплексні препарати, виявляють активність щодо колагену і эластина. При дослідженні різних субтилизинов встановлено їх висока каталитическая активність і невисока специфічність гидролитического дії, що допускає їх використання у різних харчових технологиях.
Протеиназа з Actinomyces fradiae, отнесённая до типу трипсиноподобных, здатна також гідролізувати казеїн, денатурований колаген, але з активна щодо эластина.
З культуральної рідини Bacillus mesentericum 316 М виділяють комплексний ферментний препарат, у якого високої протеолитической активністю до фибриллярным білкам, зокрема коллагену і эластину.
З відходів виробництва антибіотиків отримано протеолітичний препарат (джерело Streptomyces griseus). Вона має високої казеинолитической активністю, піддаючи у своїй гидролизу гемоглобін, эластин, колаген і желатин.
Одержання високоочищених фракцій ферментів — тривалий, складний та найдорожчої процес, а застосування комплексних препаратів який завжди дає бажаний ефект і вимагає дослідження умов гідролізу як на чистих субстратах, а й за обробці складних білкових систем. У цьому інтерес представляє як глибина протеолізу, і якісна характеристика продуктів реакції, оскільки вони сьогодні визначають як функціональні, біологічні і технологічні властивості продуктів, а й можуть виявляти фізіологічні ефекти у складі пищи.

1.2 Ферменти, їх фізико-хімічні свойства.

Протеиназы, які включають ферменти мікробного походження, становлять близько половини виробництва препаратів на світовому ринку. Їхня ефективність і потужність набагато перевершують синтетичні каталізатори. Вони високоспецифічні стосовно своїм субстратам і прискорюють суворо визначені хімічні реакції без освіти побічних продуктів; ферменти функціонують в розбавлених водних розчинах при фізіологічних значеннях рН і температуры.
Ферменти — функціональні одиниці клітинного метаболізму. Діючи у суворо певній послідовності, вони катализируют сотні многостадийных реакцій, у ході розщеплюються молекули поживних речовин, запасається і перетвориться хімічна енергія, і з простих молекул-предшественников будуються макромолекули, що входять до склад клетки.
Ферментативний каталіз відбувається з відривом довжини хімічного зв’язку, тому акт каталізу відбувається на певному ділянці поверхні макромолекули, званому активним центром. Сучасний рівень експериментальних досліджень дозволив довести, що він являє собою набір небагатьох функціональних груп, розташованих близько друг від одного й має вигляд западин, вилучень лежить на поверхні молекули ферменту. Функціональні групи активного центру можуть належати ланкам полипептидной ланцюга, дуже удалённым друг від друга. Зближення їх пов’язані з формуванням третинної структури молекули фермента.
Отож цілком логічно, що активний центр немає автономного існування. Не можна провести якусь межа між активним центром ферменту та іншою частиною білкової молекули. Саме це є одним із причин високої чутливість проблеми та лабільності активного центру до різним воздействиям.
До важливим характеристикам ферментних препаратів, які визначають можливість їх застосування практично, відносять рН, температурний оптимум, субстратную специфічність. Криві будуються з урахуванням даних, отриманих виміру атмосферного явища швидкостей реакції, плинною в буферних розчинах з різними значеннями рН.
У 1964 року було отримана в высокоочищенном стані нейтральна протеиназа Bacillus subtilis. Фермент має досить широке оптимум рН 6,5 — 8,0. У лужної області рН її активність знижується, досягаючи при рН 9,0 — 30% максимальної величини. Отже, ферменти активні лише у певному інтервалі рН. Найчастіше кожному за ферменту є певний оптимум рН. Це кількома причинами:
— справжнє, оборотне вплив рН на швидкість реакції (коли фермент насичений субстратом);
— вплив рН на спорідненість ферменту до субстрату (у разі падіння активності з обох боків від оптимуму рН буде наслідком зниження насичення ферменту субстратом з зниження сродства);
— вплив рН на стабільність ферменту, котрі можуть необоротно инактивироваться при рН на одному чи обидва боки оптимума.
Перелічені чинники можуть діяти й в комбінації друг з одним. Наприклад, падіння активності з одного боку від оптимуму рН то, можливо результатом зменшення спорідненості ферменту до субстрату, а, по іншу — результатом інактивації фермента.
Отже, всім відомих ферментів залежність швидкості реакції від рН графічно виявляється у вигляді «колоколообразной» функції. Такі криві будуються з урахуванням даних, отриманих виміру атмосферного явища швидкостей реакції, протікаючим в буферних розчинах з різними значеннями рН.
Форма кривих, що описують залежність швидкості ферментативної реакції від рН, відбиває здатність важливих для даного ферменту протон — донорних зв’язків чи протон — акцепторных груп у його каталітичному центрі переходити за певних значеннях рН до стану необхідної ступеня ионизации.
Методи аналізу температурних залежностей кінетичних і рівноважних параметрів ферментативних реакцій грунтуються на класичних принципах термодинаміки і кінетики. Ферментативные реакції характеризуються також наявністю «колоколообразной» залежності швидкості реакції від температури у досить широкому температурному інтервалі, що зумовлює температурному оптимуму реакції. Ця здатність впливу температури на кінетику ферментативних реакцій пояснюється накладенням двох ефектів (зростання швидкості реакції зі збільшенням температури і прискоренням теплової денатурації білкової молекули, що призводить до інактивації ферменту при високих температурах).
Розмаїття форм, у яких проявляється вплив температури на швидкість ферментативних реакцій, дає підставу очікувати, що «аналіз цього явища має бути великі труднощі. Насправді, проте, вплив температури легко встановити експериментально. Вплив цього чинника на стабільність ферменту можна вивчити, инкубируя фермент що за різних значеннях температури протягом певного періоду часу, а й за тим визначаючи його активність у тому температурної зоні, де він залишається стабильным.
Добре вивченими є протеиназа з Bacillus amyloliguefarias [31] і протеиназа з Bacillus thermoproteolyticus (термолизин). Вони досить близькі за своїми властивостями. Проте термостабильность їх значно різниться, так термолизин втрачає 50% максимальної активність за температурі 84оС, за 15 хвилин при рН 7,2, тоді як протеиназа Bacillus amyloliguefacieus втрачає через те водночас 50% активність за температурі 59оС.
Ферментативна реакція загалом полягає, по крайнього заходу, із трьох послідовних стадій: освіту фермент-субстратного комплексу, перетворення цього технологічного комплексу в Маріїнський комплекс фермент-продукт і дисоціація проміжного продукту. Вплив температури на реакцію загалом є наслідком її впливу кожну з цих стадий.
Відомо багато ферментів, котрим природні умови для їхньої дії не збігаються з оптимальними параметрами рН і температури. Отже, зовнішні чинники дозволяють із достатньою ефектом регулювати цікаві для процеси, особливо в технологічної обробці біологічних об'єктів, наприклад м’яса і м’ясних продуктов.
Специфічність ферментів пояснюється першу чергу збігом просторових конфігурацій субстрату і субстратного центру ферменту. Очевидно, тільки тоді ми, коли збіг це дуже повно, може утворитися фермент-субстратный комплекс і, отже, розпочатися процес ферментативного каталізу. Детальний вивчення специфічності ферментів показало, що межі її в різних ферментів різні. Одні ферменти мають абсолютної специфічністю, тобто. каталитически прискорюють одну — єдину реакцію. Прикладом такого ферменту може бути уреаза. Інші ферменти здійснюють каталіз реакцій певного типу незалежно від цього, які конкретні речовини у яких взаємодіють чи розпадаються. Основним ознакою для ферментів цього є характер зв’язку. Такі ферменти характеризуються, отже, груповий специфічністю. Нарешті, деякі ферменти відрізняються стереохимической специфічністю, тобто. діють лише на з просторових ізомерів. Прикладом можуть бути ферменти, расщепляющие ?- і ?-метилглюкозиды.
Катализируемая хімічна реакція представляє той специфічний ознака, яким один фермент відрізняється від іншого. Сучасна класифікація полягає в цьому ознаці. Ферменти ділять на групи залежно від типу катализируемой реакції і підгрупи, точніше що характеризують цю реакцию.
Часто практично протеолитические ферменти, відомі й тим паче мало вивчені, поділяються на групи залежно від оптимального значення рН дії на субстрати. Зазвичай, виділяють три группы:
1. Лужні протеиназы, стабільні і активна які у області рН 5 — 10. Максимальна їхня активність можна знайти при рН 9,5 — 10,5. Встановлено, що це переважно сериновые протеиназы (для акта каталізу важливе значення мають функціональні групи серина); вони активно ингибируются диизопропилфторфосфатом (ДФФ).
2. Нейтральные протеиназы з оптимумом рН для протеолізу близько 7,0. У цю групу об'єднують більшість металлоферментов, чутливих до таких аддентам, як ЭДТА і о-фенантролин. Не ингибируются ДФФ і тиоловыми реагентами, стійкі при рН 6 — 9.
3. Кислые протеиназы, активні при рН 2 — 5, не чутливі до сульфгидрильным реагентам, металлохелатным агентам, важким металам і до ДФФ. Для акта каталізу цієї групи ферментів важливі залишки карбоксильных груп глутаминовой і аспарагінової кислот.
Разом про те відзначимо, що залежність активність — рН носить підрядний характері і пов’язана з структурою активного центра,
визначального механізм действия.

1.3. Виділення очищення препаратів протеиназы.

Сучасний рівень науку й техніки дозволяє їм отримати як комплексні, а й гомогенні, кристалічні ферменти. Їх, зазвичай, виділяють безпосередньо з біомаси гриба чи культуральної рідини, а як і з екстрактів поверхневих культур.
Як осадителей і при отриманні комплексу препаратів протеиназ застосовують сульфат амонію [14, 17], етанол [17], ацетон, изопропанол [24].
Зазначається, що, залежно від застосовуваного осадителя вихід ферменту буває різним. Так під час використання різних органічних розчинників у незначній концентрації 80%, вихід протеолітичних ферментів становив: 56% - для етанолу, 78% - изопропанола, 65% - ацетона.
Разом про те, поєднання різних осадителей призводить до більш повного відділенню від супутніх речовин. До. А. Калунянц з співавторами [13] очищення препарату реннинопузилин П10х скористалися осадженням сульфатом амонію. Отриманий осад розчиняли у питній воді, фракционировали етиловим спиртом. У цьому авторам вдалося відокремити значну частину супутніх белков.
У такий спосіб отримують комплексні ферментні препарати. Їх можна використовувати в народному господарстві, не проводячи подальших етапів очищення. Повніша очищення можлива з допомогою таких методів поділу як гельфильтрации на сефадексе, хроматографії на ДЭАЭ-сефадексе, КМ-сефадексе, КМ-целлюлозе, ДЭАЭ-целлюлозе.
Наприклад, протеиназа Torula thermofila було виділено і очищена в партії 11 разів у результаті діалізу препарату, отриманого осадженням сульфатом амонію, із наступною гельфильтрацией на сефадексе У-100.
Для поділу коллагеназы і нейтральній протеиназы Achromobacter iophagus препарат, отриманий осадженням сульфатом амонію, піддали диализу, а як і хроматографії на ДЕ-32 целлюлозе.
Найбільш вивчені протеолитические ферменти, віднайдені Bac. Subtilis, одержані кристалічному стані. Схема очищення цих препаратів включає: высаливание сульфатом амонію 75% насичення з наступним діалізом проти ацетатного буфера. Потім двох кратну осадження 67% ацетоном і діаліз проти трисбуфера із наступною хроматографією на ДЕАЕ-сефадексе А-50 [30].
При поділі нейтральній і лужної протеиназ Asp. Oryzae ОИТ-5038 використовували осадження сульфатом амонію 80% насичення, із наступною хроматографією на ДЕАЕ-целлюлозе і сефадексе У-100.
Для відділення баластних білків і пігментів від протеиназы Asp. Terricola Войнарским розроблений метод очищення на биогеле Р-10. Через війну активність протеиназы зросла 30 раз, а зміст пігментів зменшилося в 100 раз.
Через війну ионообменной хроматографії на ДЭАЭ-целлюлозе було отримано препарат нейтральній протеиназы Streptomyces acidoresistous 1403 з десятиразової ступенем очистки.
Найбільш ефективним методом виділення, тож очищення ферментів є афинная хроматографія. Метод грунтується на використанні взаємодій, аналогічних взаємодії ферменту з субстратом. Зазвичай, ферменти, отримані з допомогою афинной хроматографії, є гомогенними чи сумішшю изоферментов. Про це свідчить даними электрофокусирования, електрофорезу в полиакриламидном гелі, визначенням амінокислотною послідовності [20].
Нині досить застосовується очищення метод ультрафільтрації розчинів ферментів. Перевагою ультрафільтрації є відсутність теплової інактивації й невеличкі енерговитрати. Ультрафильтрация дозволяє провести концентрування розчину без фазового перетворення при кімнатної температурі, за одночасного звільнення від баластних речовин (пігментів, низькомолекулярних сполук). Наприклад, Рожанская з співавторами [27] успішно використовували метод ультрафільтрації при очищенні протеиназ з Asp. terricola і Streptomyces sp.
Наведені літературні дані, що стосуються питань виділення, тож очищення протеолітичних ферментів, свідчать, що поєднання різних методів дозволяє їм отримати гомогенні ферментні препарати з культур мікроорганізмів. Застосування тієї чи іншої їх залежить від індивідуальних властивостей ферменту, кінцевої мети за його застосуванні, фізико-хімічних факторов.
Аналізуючи літературні дані, домовилися висновку, що молекулярна маса нейтральних протеиназ перебуває у інтервалі 20 000 — 50 000. Усі вони теж мають досить високий температурний оптимум, лежить у інтервалі 40 — 60oС, оптимальне значення рН 7,0 — 8,0, діапазон стабільності характеризується значеннями рН 5,0 — 10,0. Так нейтральна протеиназа Bac. Subtilis має оптимум рН 7,0 і температурний оптимум 52oС. Протеолитические ферменти Bac. Subtilis, виділені А. А. Глемжай і співробітників, мають кілька оптимумів рН (від 6,5 до 10,5). Молекулярна маса нейтральній протеиназы 38 000 — 45 000, лужної - 27 000 — 29 000.
Препарати протеиназ Pseudomonas aeruginosa 700/75 мають рН оптимум від 7,5 до 10,0. Протеиназы різних фракцій мали різними рН оптимумами. Фермент з молекулярної масою 28 000 має оптимум рН 10,5. Зменшення молекулярної маси корелювало зі зниженням оптимуму рН. Так, протеиназа з молекулярным вагою 20 000 характеризується рН оптимумом 7,0.
Відомі термостабильные препарати протеиназ. Для термостабильного ферменту, виділеного з Thermoactinomyces thalpophilus максимальна активність виявлено при рН 6,0 і зберігалася до70% за зміни рН від 5,0 до 8,0. Оптимальна температура дорівнює 70oС, та за 30 хвилин выдерживания при 70oС зберігається лише 62% активності [32].
Інша термостабильная нейтральна протеиназа — прототерпин має оптимум температури 79oC, за 60 годин інкубації при 60oС втрата активності вбирається у 15%.
Отже, рН оптимум для нейтральних протеиназ варіює від 6,0 до 8,0, температурний оптимум 40 — 60oС, проте термостабильность ферментів може варіювати у широкому диапазоне.

1.4 Розщеплення коллагенсодержащего сировини й його применение.

Перспективний напрям обробки коллагенсодержащего сировини — його ферментація. Авторами огляду [5] показано, що вжиті підвищення якості м’яса ферментні препарати повинен мати такі свойства:
— викликати зміна сполучної ткани;
— слабко діяти на м’язову ткань;
— мати максимально високий температурний оптимум дії, зберігаючи здатність частково змінювати тканини при теплової обработке;
— діяти у слабокислой чи нейтральної середовищі з максимальною активностью;
— бути нешкідливим для человека.
Практика застосування ферментних препаратів показує, що не ферменти, які мають високої протеолитической активністю, при обробці м’яса дають належний ефект. У цьому має значення оптимум дії ферментів, природа їх активаторів і інгібіторів, специфічність до розриву пептидних зв’язків при гідролізі тварин белков.
Відомо кілька радикальних способів обробки м’яса ферментами: ін'єкції розчину в кровоносну систему тварин, шприцевание розчину ферменту в шию, поверхнева обробка м’яса ферментами, додавання ферментного розчину до м’ясива фаршу.
Найприйнятнішим методом для сучасного виробництва виявилося шприцевание ферментного розчину в шию. До складу шприцуемого розчину крім ферментного препарату входить поварена сіль і харчові добавки.
Характер та глибина змін внутримышечной сполучної тканини під впливом протеолітичних ферментів залежить від специфічності протеиназ які у препаратах. Найбільш глибокі зміни соединительнотканных прошарків відбувалися під впливом фицина, т. до. цей фермент здатний гідролізувати нативний эластин за природного рН м’яса. Що ж до харчових ферментних препаратів мікробного походження, котрі мають коллагеназной і эластазной активністю, їх дію на внутримышечную сполучну тканину обмежується визволенням колагенових волокон від «цементуючого» їх основного речовини. Це зниження стійкості колагенових волокон до гидротермическому впливу і більше швидкому розм’якшенню м’яса у процесі теплової обработки.
Проводячи біохімічну оцінку м’яса, все дослідники дійшли єдиного думці, у результаті обробки м’яса ферментними препаратами перивариваемость його зростає. Певне, це пов’язано з наявністю у ньому білків вже підданих більш-менш глибокої деструкції. Особливо це ж стосується колагену і эластина білків, найбільш важко розщеплюваних травними ферментами.
Надісланий зміна вихідних властивостей сировини з допомогою ферментативної обробки найперспективніше в колбасном виробництві за скорочення термінів посла і його використання сировини з великим змістом сполучної ткани.
А. Ф. Невельниченко (1989) запропонував спосіб дозрівання м’ясного сировини, попередньо обробленого розчином протеолітичних ферментів мікробного походження (протосубтилин, протомезентерин, прототерризин) методом инъецирования. Така обробка дозволила збільшити вихід натуральних напівфабрикатів на 11% рахунок спрямування цього жорстких частин яловичих туш.
У для м’якшення сполучної тканини запропоновано тушу після забою і розбирання шприцевать водним розчином ферментів, що містить коллагеназу, отриману з Cl. histolyticum і эластазу — з свинячої підшлункової железы.
Результати досліджень з вивчення можливості ферментації коллагенсодержащего сировини в колбасном виробництві дозволив встановити следующее:
— застосування протосубтилина Г20х як самостійного ферменту, і у комплексі з ЭПЖ, викликає дуже значні деструктивні зміни, насамперед, м’язової тканини односортной яловичини, не надаючи належного впливу соединительную;
— ферментація односортной яловичини ЭПЖ сприяє поліпшенню фізико-хімічних властивостей цього сырья;
-обробку коллагенсодержащего сировини є доцільним на стадії посла м’яса або за складанні фаршу перед шприцеванием їх у оболочку.
Підвищена резистентність колагенових і эластиновых волокон до термічної дезагрегации визначає ряд пороків готових виробів. Для зниження цих негативних проявів використовують жиловку цього сырья.
Узагальнення результатів досліджень, виконаних М. М. Липатовым, В. Г. Боресковым та інших. дозволило припустити, що альтернативою операції жиловки під час виробництва м’ясопродуктів з сировини із високим масової часткою сполучної тканини є біотехнологічна модифікація такого сировини рахунок на нього протеолитическими ферментними препаратами, з коллагеназной і эластазной активностью.
Ферментирование сировини із високим масової часткою сполучної тканини сприяє підвищенню швидкості диффузионно-фильтрационного розподілу посолочных інгредієнтів при посоле такого сировини. Авторами [5] доведено збільшення рівномірності розподілу хлориду натрію при обробці сировини протеолитическими ферментами.
Особливу увагу розробці спеціальних ферментних препаратів приділяється останнім часом у зв’язку з проблемою максимальне залучення вторинних білкових ресурсів немає і відходів м’ясної в промисловості й створенням безвідхідних технологій. Забезпечення стійкого піднесення у цьому напрямі можна досягнути завдяки розробці ефективних мікробних препаратів. Спроможність синтезувати специфічні ферменти, расщепляющие тварини білки, мають багато мікроорганізми. У тому числі виділяються види, ефективно гидролизующие білки типу колагену, эластина, кератина. Показана можливість застосування цих цілей протеолітичних ферментів з урахуванням Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Aspergillus, Penicillium.
З використанням коллагенофильного препарату ферментів з Penicillium wortmannii ВКМ — 2091 ступінь гідролізу коллагенов сягає 60 — 65%.
Аналіз гідролізатів свідчить про багатий набір і високий вміст вільних амінокислот: пролина, цистину, валина, аланина, изолейцина, лейцину, фенілаланіну, лізину, серина, глутаминовой і аспарагінової кислот. У цьому перевариваемость сировини збільшується в 2,0 — 2,5 разу. Такі гідролізати є чудовою підвалинами отримання харчових добавок, модифікованих продуктів і кормових концентратов.
Ряд методів отримання ферментативних гідролізатів запропонований французькими дослідниками, використані ферменти тваринного (панкреатин, трипсин, хімотрипсин), рослинного (фицин, бромелаин, папаин) і мікробного (B. subtilis Str. fradiae Str. griseus) происхождения.
У Німеччині отримують гідролізати з малоцінних продуктів переробки тушок птахи. У измельчённое сировину вносять препарати з B. subtilis, A. оryzae, P. latex, A. melleus. Гидролизат сушать й використовують на приготування супів. У цьому втрати амінокислот, зокрема, лізину, минимальны.
Зарубіжні автори розробили засоби одержання харчових гідролізатів шляхом автолиза сировини які у ньому ферментами. Рекомендовано також отримуватимуть харчові гідролізати з кісткового залишку після механічної обвалки тушок птахи. Відповідно до цього способу щоб одержати гідролізатів використовують мікробні протеолитические препарати з B. subtilis, P. latex, A. melleus.
Для ефективного гідролізу білків тваринного походження пропонується ряд комбінованих способів. У цьому застосовується попередня кислотна чи лужне обробка, та був — ферментативний гидролиз.
Останнім часом виріс практичний інтерес до способів раціонального використання малоцінних коллагенсодержащих продуктів забою птахи щоб одержати білкових гідролізатів, які знаходять застосування як як компонент їжі, а й як дієтичний продукт для лікувального харчування. Вітчизняні дослідниками проведено праці та досягнуто хороші результати одержання гідролізатів з голів і ніг сухопутної птахи. Для ферментативної обробки з наступним отриманням белково-жировой емульсії пропонується використання препаратів ферментів з P. wortmannii ВКМ-2091 і Str. chromogenes graecus 0832, які, відповідно більшою мірою мають коллагеназной і кератинолитической активностями.
Конкретні умови гідролізу, певні з допомогою методів математичної статистики, стали основою нового способу отримання белково-жировой добавки — замінника основної сировини в рецептурах фаршевых м’ясних виробів. Спосіб ось у чому: промиті свіжі ноги і голови сухопутної птахи подрібнюють, та був гомогенизируют з додаванням води. Це необхідне руйнації тканинних структур і часткової механічної деструкції особливо міцних білків — колагену і кератина. Измельчённое сировину (гомогенаты) нагрівають до 80 — 90оС для часткової деструкції усталених білків. Потім сировину піддають ферментативної обработке.
Підготовлені гомогенаты сировини охолоджують і вносять специфічну энзимную композицію з урахуванням мікробних препаратів. Через війну максимально утворюються водорозчинні білкові фракції, перивариваемость гідролізату в 2,0 — 2,5 разу вищу, ніж вихідного сырья.
Виготовлені відповідно до рекомендаціями і технологічними інструкціями готові вироби мають хороший товарний вигляд, високі смакові властивості біологічну цінність зі збільшенням виходу 1,5 — 3,0%.
Аспекти застосування на харчові мети специфічного коллагенсодержащего сировини — шквары, яку за вигляді відходу при вытопке жирів і що містить 22 — 44% білків (переважно коллагенов), відомі [3].
Гомогенизированная шквара — цінне білкове сировину. У її складі присутні такі незамінні амінокислоти, як валин, лізин, фенилаланин. Заради покращання функціонально-технологічних властивостей шквары також доцільно застосування ферментів, специфічних до гидролизу фибриллярных білків. У нейтральній зоні рН при поміркованих температурах найефективнішими виявилися протеолитические препарати глибинної культури микромицета Penicillium wortmannii.
Отриманий гидролизат відрізняється такими показниками: значна частина вільних амінокислот і спільні зміни у фракційному складі белков.
Через війну порушення белково-липидных комплексів створюються умови для отримання жира.
Можливості гідролізатів різного коллагенсодержащего сировини мають величезні перспективи і при отриманні спеціальних продуктів, зокрема профилактических.
Застосування ферментних препаратів при обробці шкіряного сировини одна із перспективних методів вдосконалення технологічних процесів шкіряного производства.
Присутність у шкурі розчинних і нерозчинних компонентів різної хімічної природи, багатоступінчаста структурна організація основного білка шкіри — колагену — визначають складний характер реакцій при ферментативної обработке.
Серед підготовчих процесів шкіряного виробництва найбільш трудоёмким є обезволашивание. Найперспективнішим всім видів сировини виявився обезволашивание з допомогою ферментів. Задля досягнення ефекту обезволашивания встановлено доцільність застосування ферментів, діючих на різні класи сполук дерми — білки, вуглеводи, жирові речовини, чільне місце серед яких належить спеціальним протеазам. Основний чинник прискорення процесу — на зміну структури дерми, що сприяє збільшення її проникності і пористости, швидкості проникання ферменту до волосяний сумке.
Однією з напрямів у проведенні ферментативних обробок є застосування композицій ферментних препаратов.
Завдяки ферментативным обработкам, втрати колагену на 20 — 30% менше, аніж за традиційних методах, у своїй зі шкіри видаляється переважна більшість неколлагеновых білків, вуглеводів, аминосахаров й відбувається поділ структурних компонентів колагену. Це дає змогу провадити наступне золение на більш м’яких умовах, із зменшенням концентрації хімічних реагентів і тривалості процесса.
Важливою операцією отриманні м’якої шкіри з гладкою шовковистої лицьової поверхнею, є процес м’якшення голья. У процесі м’якшення під впливом ферментів в покидьки происходит:
— розкладання кератозы, видалення неї і інших продуктів розпаду білків, гідроліз залишків епідермісу, гідроліз і видалення межволоконных речовин, эмульгирование і видалення липидов;
— видозміну эластиновых волокон;
— поділ колагенових волокон деякі фибриллы.
Однією з напрямів вдосконалення процесу м’якшення є використання ферментних препаратів, які у кислої середовищі, що дає можливість поєднати у один процес м’якшення і пикелевание. М’якшення у кислому середовищі сприяє отриманню однорідної грифа і плинності у всій площі кожи.
Через ряд істотних переваг, перевагу віддається мікробним препаратів. У тому числі позитивно опробированны препарати, отримані з грибів Aspergillus, бактерій Bacillus, актиноміцетів [1,4].
Через війну відбору мікробних продуцентів авторами [5] запропоновані Penicillium wortmannii ВКМ — 2091 і Streptomyces chromogenes s. graecus 0832. Встановлено, що Str. chromogenes найбільш кератинофилен, однак за рівнем коллагеназной активності цей продуцент був поранений нижче промислового B. subtilis. Високим рівнем коллагеназной і кератиназной активність за гідролізі пера відрізняються протеолитические комплекси ферментів P. wortmannii, які включають дві специфічні протеиназы з різними фізико-хімічними властивостями, задовольняють вимогам м’ясної промисловості [2].
Цілеспрямоване застосування комплексу ферментів відкрило перспективи до створення принципово нового підходи до обробці кишкового сировини щоб одержати натуральної ковбасної оболонки. У цьому трудоёмкие процеси механічного оброблення можливо замінити застосуванням ферментних препаратов.
Відомо, що серозний шар, підлягає видалення, включає жирові і білкові компоненти. Для їх руйнації розроблений в Московської державної технологічної академії харчових виробництв і отримано у дослідно-промислових умовах препарат шляхом высушивания культуральної рідини Rhizopus oryzae.
Порівняльні гістологічні дослідження тканин кишкового сировини, обробленого механічним і ферментативным способами, показали повністю ідентичну структуру. Однак якщо ферментативної обробки поверхню не деформована, у ньому повністю відсутні штрихи, порізи та інші механічні дефекты.
Розроблене технічне рішення має низку переваг: повністю замінюється складне електромеханічне устаткування за разрыхлению і видалення серозних шарів (шляма), відсутні розриви кишок, підвищується якість сировини, поліпшуються умови труда.
Основне завдання отримання колагенових мас є максимальна очищення вихідного сировини й виділення цільового продукту — колагену — у вільному від домішок вигляді. Як ферментних препаратів використовують прототерризин П10х (джерело Asp. terricoba) чи протосубтилин Г10х (джерело Bac. subtilis). Спосіб характеризується високим рівнем очищення вихідного сировини від баластових компонентів під впливом ферментів микробиального походження, їхньої низької собівартістю, високим рівнем екологічності производства.
Складність і трудоёмкость приготування препаратів ферментів, втрата значної частини колагену внаслідок неповної його екстракції і денатурації під впливом підвищеної температури, діючої тривалий час, знижують значення методів обробки колагену протеолитическими ферментами тварини рослинного походження. Нові перспективи якої і реальна можливість запровадження біотехнологічних методів у виробництво виникає під час використання мікробних ферментних препаратів, відмінних високої стабільністю, можливістю варіювати специфіку біохімічних властивостей. Було проведено вивчення ефективності ферментативного гідролізу баластових компонентів різних коллагенсодержащих джерел із застосуванням низки мікробних препаратів: протосубтилина, протомегетерина, липоризина, виділених з відповідних мікроорганізмів (B. subtilis, B. megaterium, R. oryzae).
Отже, для м’ясної промисловості найбільшу перспективу мають мікробні ферментні препарати і клітини, характерні специфічної активністю щодо фибриллярных білків усталеної структуры.
Оцінка ефективності біотехнологій переробки коллагенсодержащего сировини передбачає економію 10 — 20% основної сировини і при отриманні повноцінних м’ясних продуктів і 70 — 100% - у разі вироблення штучних оболонок і плёнок.
Застосування специфічних ферментних препаратів і клітин дозволяє здійснити принципово нові технологіії глибокою моральністю і комплексної переробки основного, вторинної сировини і харчових відходів у реалізації режимів у природних діапазонах температури, рН середовища проживання і тиску, мінімальними енерговитратами, без додаткових капітальних вкладень і небажаних екологічних воздействий.
ГЛАВА 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Визначення величини рН.

Значимість рН визначали потенциометрически на рН-метре ЛПУ-01. Для вимірів значень рН розчинів в температурі відмінній від 20oС, застосовували автоматичну компенсацию.

2.2 Метод визначення протеолитической активности.

Протеолитическую активність (ПА) визначали по ГОСТ 20 264. 2−74 [12]. Субстратом служив 2% розчин казеината натрію, якого додавали 2 см³ розчину ферменту і поміщали в ультратермостат за нормальної температури 30oС. Після завершення гідролізу протягом десяти хвилин, у досвідчену пробірку доливали 4 см³ розчину трихлоруксусной кислоти. Витримували ще 20 хвилин за нормальної температури 30oС. Потім фільтрували у сухе пробірки. До 1 см³ фільтрату додавали 5 см³ 0,5 М розчину карбонату натрію, перемішували і додавали 1 см³ робочого розчину Фолина. Через 30 хвилин вимірювали оптичну щільність розчину на ФЭКе КФК-2 при 670 нм в кюветах з що поглинає світло шаром 10 мм проти контролю. За одиницю ПА приймають стільки ферменту, яке за 1 хвилину при 30oС катализировало перехід у неосаждаемые трихлоруксусной кислотою продукти гідролізу казеината натрію у кількості, відповідному 1 ммолю тирозина (1ммоль тирозина дорівнює 0,181мг).

2.3 Визначення коллагеназной активности.

Коллагеназную активність визначали за змістом оксипролина в суміші, що утворився результаті дії ферменту на нативний колаген. Для цього він готували реактив для окислення: 28,2 р хлораміну Т розчиняли в 40 см³ води щоб одержати 0,05 М концентрації, додавали 60 см³ ацитат-цитратного буфера з рН 6,0. До 2 см³ аналізованої проби, що містить 2 — 20 см³ оксипролина, доливали 1мл реактиву для окислення, розворушували і залишали на 20 хвилин при кімнатної температурі. Потім у суміш вносили 2 — 1 см³ 4 М хлорним кислоти, розворушували і крізь 5 хвилин доливали 3 см³ 10% розчину n-диметиламинобензальдегида в метилцеллосольфе. Пробу нагрівали 15 хвилин, у водяній бані при 150оС і після охолодження фотометрировали з зеленим світлофільтром на ФЭК-56М (555нм).
Гідроліз колагену вели у таких умовах: 20 мг нативного колагену обробляли досліджуваним ферментным препаратом у присутності буферної системи з рН 7,0 те щоб загальний обсяг становив 25 см³. Суміш инкубировали протягом 1 години при 37oС. Контролем служили проби, инкубированные у тих-таки умовах, але не матимуть ферменту, попередньо зупинивши реакцію внесенням 0,5 см³ етанолу та центрифугированием суміші протягом 15 хвилин при 6000 ч? мин-1.
Активність коллагеназы висловлювали або у ммолях оксипролина на 1 мг білка за 60 хвилин, або у відсотках растворения.

2.4 Визначення молекулярної маси фермента.

Молекулярну масу визначали з допомогою гель-фильтрации на сефадексе У-100. Розрахунок проводили по формуле:
LgM=5,941−0,847 (V/V0),
де V — обсяг виходу фермента;
V0 — вільний обсяг колонки.

2.5 Визначення змісту аминного азота.

Метод грунтується освіті кольорового комплексу при взаємодії аминогрупп амінокислот з гидроксидом міді. У пробірку, що містить 100 мг сухого мідного реактиву, вносили 4 см³ аналізованої проби, попередньо нейтралізованої сухим бикарбонатом натрію, витримували 15 хвилин періодично струшуючи. Потім центрифугировали і вимірювали оптичну щільність на ФЗКе КФК-2 при 590 нм. У контролі замість 4 см³ проби було присутнє 4 см³ дистильованій води. Зміст аминного азоту розраховували по каліброваної кривою, побудованої для відомих аминокислот.

2.6 Электрофоретические исследования.

2.6.1 Визначення гомогенності очищених препаратов.

Електрофорез проводили методом Девіса на приладі фірми Reanol (Угорщина) в лужної буферної системі, рН 8,9. Концентрація акриламина в мелкопористом гелі становила 5%. Довжина мелкопористого гелю в трубочці становила 5,5 див. Розчини для полімеризації готували звичайним способом. Обстежуваний зразок, у якому 20 — 30 мкг білка змішували у відсотковому співвідношенні 1: 1 з 40% розчином сахарози і завдавали на трубочку з гелем. Обсяг зразка не перевищував 0,2 см³. Поверх зразка обережно наслаивали електродний буфер, який містив один л 0,6 р трис-(гидроксиметил)-амино-метана і 2,88 р глицина.
У верхній резервуар приладу вносили 1 см³ 0,001% розчину бромфенолсинего контролю руху фронту рухливих іонів. У перші 10 — 15 хвилин сила струму становила 1мА на трубочку, та був 2,5мА. Після закінчення электрофоретического поділу гелі виймали з трубочок й провели забарвлення. Забарвлення проводили розчином амидочерного з масової часткою 0,5, приготовленого з масової часткою 7 оцтової кислоти. Забарвлення проводили 20 — 30 хвилин. Барвник відмивали з масової часткою 7 оцтової кислотою з многократной зміною раствора.

2.6.2 Ідентифікація протеиназ в ПААГ [16].

Для прояви у гелях смуг з протеиназой їх витримували в денатурованому розчині гемоглобіну 2% концентрації протягом 15 — 30 хвилин за нормальної температури 30oС. Потім промивали кілька разів дистильованої водою і переносили в розчин амидочерного. Проводили забарвлення протягом 20 — 30 хвилин. Барвник відмивали 7% оцтової кислотою. Якщо гелях була присутня протеиназа, то з’являлися білі полосы.

Усі досліди, достойні роботі, проводили 3 -4 разу, аналітичні визначення кожної проби проводили у двох — трьох повторностях. У таблицях і малюнках показані дані типових дослідів, причому кожне значення є середнім з цих двох чи трьох визначень. Обговорюються ті результати, хто був відтворювані у кожному опыте.
ГЛАВА 3. ОТРИМАННЯ ПРЕПАРАТІВ ПРОТЕИНАЗЫ
PENICILLIUM WORTMANNII 2091 І ДОСЛІДЖЕННЯ ИХ
ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ СВОЙСТВ.

Відомо, що мікроорганізми синтезують багаті набором ферментів комплекси. Тому важливим етапом отриманні препаратів спрямованого дії вивчення умов його виділення, очищення від супутніх біологічно активних і баластних речовин. У зв’язку з малої вивченістю представників грибів Penicillium цей етап представляє особливу важность.

3.1 Розробка умов виділення препарата
Penicillium wortmannii BKMF 2091.

Для виділення ферментів із різних середовищ в лабораторних умовах й у промисловості найчастіше застосовують органічні розчинники і нейтральні соли.
Ефект осадження білків органічними розчинниками, як відомо [7], грунтується на явище зменшення сольватации полярних груп ферменту. Молекули води, розташовані на гидрофобных ділянках поверхні білка, може бути заміщені на молекули органічного розчинника. У цьому розчинність білків падає, відбувається агрегирование і осадження білкових молекул.
Як осадителей використовували 96,5% етанол, 98,0% изопропанол, хімічно чистий ацетон і сульфат амонію. Органічні розчинники і сульфат амонію додавали до охолодженою до 0 — 4oС культуральної рідини Pen. Wortmannii 2091 що за різних значеннях рН і постійному перемішуванні. Виниклий осад відокремлювали центрифугированием, розчиняли у невеликому обсязі дистильованої води та визначали протеолитическую активность.
Результати дослідження впливу рН на повноту осадження протеолитического комплексу при концентрації розчинників 60% представлені на рис. 1, з яких видно, що оптимальною є значення рН 7,5 під час використання всіх видів органічних розчинників. Мабуть, изоэлектрическая точка для даного ферменту лежить у цій області рН.
Надалі нами проводили дослідження щодо впливу концентрації органічних розчинників для виходу ферменту за оптимального значенні рН. Спостерігалися монотонне осадження ферменту при послідовному збільшенні концентрацій осадителей, вихід ферменту зростав до певного краю (табл. 1).
Як очевидно з табл. 1, концентрація органічних розчинників значно впливає як у вихід протеолитического комплексу, і на ступінь його очищення. З використанням етанолу найефективнішою для виходу ПА була концентрація 72,0%. Ступінь очищення 1,27. Максимальний вихід 98,5% по активности.
Оптимальна концентрація ацетону 66,6% (в чималеньких за обсягом співвідношеннях 1: 2). Ступінь очищення була високої, ніж для етанолу (1,5 разу) — проте вихід за активністю всього 62%. Кращим органічним осадителем для протеиназы Pen. Wortmannii 2091 з’явився изопропанол. При концентрації їх у суміші 50% вихід протеиназы становив 90, 5%, ступінь очищення 2,78 і питома активність 3,06.
Таким чином, изопропанол вибірково бере в облогу протеолитические ферменти, що підвищує ступінь їх очищення знижує зміст баластних домішок. Проте за практиці цілком можливо використовувати й этанол.
Надалі проведено дослідження з осадженню протеиназы сульфатом амонію. Встановлено, що з оптимальних умовах (ступінь насичення 0,8 рН 7,5) вихід ферменту становив лише 23%. Низький вы-


Таблиця 1
Одержання препарату протеиназы з культуральної рідини Penicillium wortmannii 2091
осадженням органічними растворителями.
Зміст осадителя Загальна активність, од Білок, мг/см3 Загальний білок, мг Вага препаратів, мг Питома активність, ед/мг білка Вихід за активністю, % Очистка
У чималеньких за обсягом відносинах У %
Ацетон
Культуральная рідина рН 7,5
— - 2,5 2,250 62,5 — 1,10 100,0 1,00
1:1 50 179,0 0,180 21,6 120 0,99 17,4 0,90
1:2 66,6 222,0 0,133 46,4 349 1,67 62,0 1,50
1:3 75,0 213,0 0,233 51,9 223 0,91 38,0 0,82
1:4 80,0 203,0 0,216 64,6 299 0,94 49,0 0,85
Изопропанол
Культуральная рідина рН 7,5
— - 2,5 2,250 62,5 — 1,10 100,0 1,00
1:1 50,0 392,0 0,128 36,9 288 3,06 90,5 2,78
1:2 66,6 385,4 0,232 67,4 290 1,65 92,0 1,50
1:3 75,0 215,0 0,282 211,5 350 0,76 60,0 0,69
1:4 80,0 183,0 0,132 42,2 320 1,39 46,0 1,26
Этанол
Культуральная рідина рН 7,5
— - 2,5 2,250 62,5 — 1,10 100,0 1,00
1:1 48,0 320,3 0,396 85,1 215 0,80 55,0 0,73
1:2 64,0 366,7 0,340 90,1 265 1,08 77,6 0,98
1:3 72,0 385,4 0,276 135,2 320 1,40 98,5 1,27
1:4 80,0 349,6 0,250 160,0 335 1,40 93,7 1,27

хід ферменту перешкодив надалі використати цю сіль щоб одержати препарату Pen. Wortmannii BKMF 2091.
З аналізу вышеприведённых даних можна дійти невтішного висновку, що з осадження препарату протеиназы доцільно застосування етанолу та изопропанола. Залежно від призначення препарату можливо застосування цьогорічних чи іншого розчинника з однаковим эффектом.

3.2 Фракціонування протеолитического комплексного
препарату ферментов.

Отриманий осадженням органічними розчинниками препарат нами названо «протовортманин Г10х». Надалі представляло інтерес вивчити її компонентний склад парламенту й ідентифікувати протеолитические фракції. І тому використали метод дискового електрофорезу в ПААГ. Электорофорез вели з урахуванням «нейтральной''природы протеолитического комплекса.
Компонентний склад препарату представлений чотирма фракціями, несхожими рухливістю в електричному полі, розмірами і інтенсивністю забарвлення білкових полос.
Ідентифікацію протеолітичних фракцій проводили двома шляхами: насиченням ПААГ денатурованим гемоглобіном (pH 7,2) після дискового електрофорезу і виявленням прогидролизованных ділянок; екстракцією білкового спектра з ПААГ дистильованої водою з визначенням протеолитической активності у экстрактах.
При гідролізі гемоглобіну в ПААГ виявлено дві протеолитические фракції, які виявилися як двох світлих смуг. Це засвідчила, що ферментів, гидролизующий білки в нейтральній області pH складний і представлений двома фракціями. Аналогічними були дані під час використання методу екстракції білкових смуг з геля.
Отже, використовуючи методи дискового электофореза було встановлено, що компонентний склад отриманого препарату представлений чотирма фракціями, дві у тому числі протеолитические. Крім активного протеолитического комплексу препарат «протовортманин Г10х» містив у своєму складі глюкоамилазу (ГЛА 20ед/г) і альфаамилазу (3ед/г), супутні ферменти, і навіть баластные речовини. Для отримання гомогенних протеолітичних фракцій необхідно провести глибший очистку.

3.3 Вплив температури і рН на активність фермента.

Нами поставили за мету визначити рН і температурні оптимуми дії виділених протеиназ Penicillium wortmannii 2091 і дати їх порівняльну характеристику.
Потрібне значення рН субстрату підтримували з допомогою 0,1 М універсального буфера. Гідроліз вели за нормальної температури 30оС за тридцяти хвилин. Ферментативну активність визначали стандартним методом [12].
Як бачимо на мал. 2, препарат виявляє певну активність у широкій зоні рН. Проте максимум активності спостерігається що за різних значеннях рН. Протеиназа 1 має оптимальне значення рН 7,2, тоді як протеиназа 2 — 10,0. Отже, протеиназа 1 має нейтральну природу, а протеиназа 2 — щелочную.
Температурний оптимум дії ферментів визначали в інтервалі температур 30 — 80оС при оптимальних значеннях рН 7,2 і 10,0. На рис. 3 показано вплив температури на активність ферментів. Для протеиназы 1 максимальний гідроліз спостерігається за нормальної температури 60оС, а протеиназы 2 — 40оС.
Отже, протеолітичний комплекс Penicillium wortmannii 2091 представлений двома ферментами, мають різні температурні і рН — оптимумы.





3.4 Визначення молекулярної массы.

Молекулярну масу ферментів Penicillium wortmannii 2091 визначали методом гель-фильтрации на сефадексе У-100 [8].
Встановлено, що співвідношення обсягу элюента, який буде необхідний винесення досліджуваного білка з колонки (V — обсяг элюента) і обсягу элюата, що розміщається у вільному (не яке зайняте гранулами сефадекса) просторі колонки (V0 — вільний обсяг), назад пропорційно величині молекулярної маси білка. Для розрахунку використовували формулу:
LgM=5,941−0,847 V/V0
Молекулярна маса протеиназы 1 дорівнювала 34 500, протеиназы 2 — 20 800, тобто. обидві фракції ставляться до низкомолекулярным белкам.

3.5 Дослідження процесів кислотною та термічним инактивации.

Вивчення термо- і рН-стабильности ферментів часто несе прикладної характер.
Дослідження цих характеристик проводиться залишкової активністю ферменту після витримки його розчину протягом певного часу за певних рН і температурі [11].
Нами було проведено дослідження кінетики кислотною та термічним інактивації протеиназ Penicillium wortmannii 2091 і кінетичні параметри цього процесса.
Під час вивчення термо- і рН -стабільності розчин препарату витримували в фосфатном буфері буде в діапазоні рН від 5,0 до 12,0 і температур від 30 до 60оС. Періодично відбирали аликвотные частки розчину і визначали залишкову протеолитическую активность.
Отримані результати по інактивації обох ферментів показали, що протеиназа 1 зберігає активність широтою діапазону рН. При значенні рН 7,0 через 200 годин фермент зберігає близько 90 відсотків% активності (рис. 4). При значеннях рН 6,0 — 9,0 активність ферменту знижується до70 — 75%, це те що, що фермент у зазначеному інтервалі уникає автолизу, отже, його нативная конформація має високої стабільністю. При значеннях рН нижче 6,0 і від 11,0 каталитическая активність ферменту швидко снижается.
В усіх випадках ПА/КлА-const, це засвідчує лише тому, що ми маємо справу з однією ферментом.
Термічну інактивацію протеиназ вивчали у інтервалі температур 30 — 60оС. Протеиназа 1 у сфері високої рН-стабильности инактивируется майже зовсім за нормальної температури 60оС протягом 60 годин, тоді як протеиназа 2 нині ж температурі инактивируется повністю за 3 години. Дані свідчить про високої термостабильности протеиназы 1. Інактивація протеиназы 2, що відбувається за високої температури, очевидно, визначається процесом розгортання білкової глобулы.
Протеиназа 1, що має коллагенолитическим дією, нас цікавить із практичною погляду, тому було спрямовано деякі кінетичні характеристики при цьому фермента.
Якщо припустити, що у кожному елементарному акті процесу інактивації ферменту під впливом М+ - іонів бере участь одна його молекула, то кислотну інактивацію можна як реакції першого порядку. Кінетичне рівняння першого порядку має вид:
2,303 lg E0/E=K,
де Е0 — вихідна активність фермента
Є - активність в останній момент времени
До — константа швидкості інактивації, характеризує втрату активності у протягом години, час-1.



Залишкову активність висловлювали у відсотках від вихідної і далі використовували у расчётах констант інактивації. Значимість знаходили, як середнє з 5 — 6 визначень (табл. 2).
Таблиця 2.
Кислотна інактивація протеиназы 1 за нормальної температури 500С.
?, год Значення рН
5,0 7,0 9,0 11,0
Є К*103ч-1 Є К*103ч-1 Є К*103ч-1 Є К*103ч-1
0 100 2 100 2 100 2 100 2
12 65,1 37,0 100 2 100 2 63,2 38,1
24 45,2 33,6 92,3 2,33 92,3 2,33 42,3 36,0
48 16,8 37,7 88,0 2,54 87,8 2,54 18,1 36,3
96 7,6 36,8 81,0 2,23 81,5 2,19 7,0 37,1
120 6,7 35,7 66,3 2,50 68,2 2,30 6,5 37,7
144 6,5 33,1 62,2 2,56 60,9 2,54 6,0 34,0

Як очевидно з табл. 2, при певному рН, значення констант досить близькі друг до друга, максимальне відхилення від середніх значень вбирається у 10 — 15%, що цілком можна в дослідженнях кінетики хімічних реакцій. Це свідчить про тому, що інактивації протеиназы 1 є першого порядку. Відмінності в значеннях при рН 5,0 і 11,0 і за рН 7,0 — 10,0 аж на порядок вкотре свідчить про лабільність ферменту в слабко — кислої і найгірш — лужної зонах.
Дослідження термічної інактивації протеиназы 1 що за різних значеннях рН дозволили розрахувати константи інактивації для температур 30, 40, 50, 60оС, та був знайти термодинамические параметри цього процесса.
Термодинамические розрахунки було проведено лише вищевказаних температур (табл. 3).

Таблиця 3.
Термодинамические характеристики активованого комплекса
протеиназы I.
t, oC PH Еакт? М? ?F? ?SДж*К-1*моль-1
Дж*моль-1
30−60 5,0 245,8 244,6 53,2 600,3
30−40 7,0 75,6 72,0 68,1 13,6
40−60 7,0 300,5 298,2 60,0 734,9
30−40 9,0 72,4 71,0 69,9 9,9
40−60 9,0 295,9 294,1 60,0 723,9
30−40 11,0 255,9 253,6 54,9 624,3

Оскільки інактивація протеиназы була необоротною, визначення энтальпии? М?, вільної енергії ?F? і ентропії ?P. S? скористалися теорією абсолютних швидкостей Эйринга.
При підвищенні температури швидкість інактивації зростає. Це можна пояснити тим, що теплова енергія руйнує гидрофобные взаємодії, котрі грають значної ролі в стабільності білків. У результаті відбувається розгортання полипептидной ланцюга, що підтверджено високими значеннями? P. S? і цілком узгоджується з літературними данными.
Отже, зміна величини рН викликає руйнація електростатичних зусиль і на вирішальній ролі цих умовах у процесі інактивації грають, очевидно, гидрофобные взаимодействия.

3.6 Вплив іонів металів і інгібіторів на активний центр фермента.

Головною ознакою, що використовуються при відношенні протеолітичних ферментів до того що чи іншому класу, є будова каталітичного центра.
За відправну точку до вивчення будівлі активного центру, механізму каталізу є ідентифікація функціональних груп, яка досягається комплексними дослідженнями й у першу чергу, застосуванням специфічних інгібіторів. У наших дослідах як інгібіторів було використано ЭДТА, монойодуксусная кислота, n-хлормеркурийбензоат натрію, фенилметилсульфатонилфторид, диизопропилфторфосфат, перманганат калия.
Розчини ферментів, містять 5?10−3М цих сполук, витримували при 30оС впродовж часа.
Як засвідчили результати дослідів, протеиназа 1 повністю инактивировалась ЭДТА — ингибитором металлоферментов, інші ферменти не змінювали протеолитическую активность.
Протеиназа 2 инактивировалась монойодуксусной кислотою і n-хлормеркурийбензоатом натрію на 84 і 63% відповідно. Фермент втрачав активність при вплив фенилметилсульфатонилфторидом і диизопропилфторфосфатом, це дає можливість припустити, що протеиназа 2 належить до «сериновым». Не надавав впливу не лише на з протеиназ перманганат калію, що свідчить про відсутність активному центрі карбоксильной группы.
За підсумками даних можна припустити, що протеиназа 1 належить до «металлоферментам», а протеиназа 2 — до «сериновым».
Згодом було цікаво розглянути впливом геть протеиназы гистидина. На протеиназу 2 не надавав ингибирующего дії, тоді як повністю ингибировал протеолитическую і коллагеназную активності протеиназы 1. З літератури відомо, що гистидин є ингибитором коллагеназ. У зв’язку з ніж очевидно, що протеиназа 1 є ферментом, котрі виявляють властивості протеиназы з коллагеназным действием.
До специфічних реагентам ставляться також іони металів. Вони можуть надавати ингибирующий чи активуючий ефект. У наших дослідах ми використовували солі двовалентних металів як хлоридів і концентрації 0,005 М. Фермент витримували в солі, та був визначали залишкову активність. Іони Mn2+, Ca2+, Ba2+ мало надавали ніякого впливу активність обох протеиназ; Zn2+, Co2+ незначно ингибировали обидва ферменту, іони Cd2+, Cu2+ ингибировали протеиназу 1, а протеиназа 2 ингибировалась іонами Fe2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+. Результати представлені у таблиці 4.
Таблиця 4.
Вплив іонів металів на активність протеиназ Penicillium wortmannii 2091.
Іон металу С=0,005 М Ферментна активність, % від исходной.
Протеиназа I Протеиназа II
Mn2+ 100,0 95,39
Ca2+ 100,0 100,0
Ba2+ 100,0 100,0
Zn2+ 95,2 95,2
Co2+ 93,9 95,2
Cu2+ 34,5 19,2
Cd2+ 20,4 20,8
Ni2+ 98,5 67,5
Fe2+ 97,9 44,9

3.7 Субстратная специфичность.

У вивченні протеолітичних ферментів значне останнє місце посідають дослідження специфічності їхні діяння. У літературі немає даних, що стосуються питання специфічності дії протеиназ грибків роду Penicillium. У зв’язку з цим досліджувалася здатність протеиназы 1 до гидролизу деяких пептидних связей.
Дослідження проводили на синтетичних пептидах і різних білках. Результати обстеження засвідчили, що протеиназа 1 гидролизовала досить широке спектр пептидних зв’язків. Вона розривала зв’язку в пептидах: цис — червона, про — червона, гли — лей, гли — позначок, червона — гли — гли, червона — гли — фен. Слід зазначити, що гидролизу піддавалися зв’язку, характерні для білків тваринного походження. У зв’язку з цим ми досліджували специфічність дії протеиназы на тварин білках. Як субстратів використовувалися: казеїн, гемоглобиин, денатурований мочевиной, кератин, колаген, желатину. Лише при й тієї концентрації ферменту найактивніше розщеплюється казеїн (78 — 80%) і гемоглобін (60 — 62%), потім слабше желатину і колаген. Найменше гидролизу піддається кератин (22 — 25%) (рис. 5).

3.8 Гідроліз коллагенсодержащего сировини: ноги птахів, шквара.

М’ясна промисловість має значною кількістю шквары, одержуваної при перетопке яловичого і свинячого жиросырья. Аналіз хімічного складу шквары свідчить про значному змісті у ній білкових речовин й неоднозначно підтверджує доцільність її використання як і колбасном, і ряд інших виробництв. Загальне зміст білка в шкваре коливається не більше 65 — 80%. До складу білків входять 22 — 44% колагену та19 — 30% эластина. Проте використання шквары обмежувалося через великі змісту сполучної тканини. Нині сполучну тканину розглядають не як билластное речовина, бо як необхідна компонента харчування [10]. У зв’язку з цим зростає практичний інтерес до раціональному та повного використанню шквары на харчові мети, розробці шляхів підвищення її біологічної цінності. Цей новий напрям стало основою розроблюваної нами темы.
Для отримання гідролізу шквары доцільно використання протеиназ, расщепляющих білки в нейтральній зоні рН і головних дійових на коллаген.



Нами провели з порівняльного аналізу промислових препаратів, які мають цією властивістю і отриманого препарату (табл. 5).
Таблиця 5.
Характеристика протеолітичних властивостей і рівня гідролізу гомогената шквары під впливом різних ферментних препаратов.
Фермент Масова частка, % рН ПА, ед/см 3 Аминный азот, мг на см3 субстрата
Протовортманин 0,1 7,2 0,838 7,616
Протосубтилин 0,1 7,2 0,0476 5,068
Панкреотин 0,1 7,2 0,0570 4,868
Пепсин 0,1 7,2 — -
Пигмауесин 0,3 7,2 — -
Контроль — 7,2 — 0,000

Контролем служила середовище, де замість ферменту була додана дистилированная вода в аликвотном количестве.
Згідно з отриманими результатам, препарат протовортманин найефективніший і при отриманні білкового гидролизата.
Надалі нами було визначено умови ефективнішої роботи ферменту. Наші дослідження обмежувалися вивченням впливу гидромодуля середовища, температури, тривалості гідролізу, дозування препарату, т. е. параметрів, граючих вирішальне значення для розроблюваної технологій і які впливають економіку процесса.
Протеолитические ферменти катализируют реакцію розщеплення білків з участю води. У зв’язку з цим важливим моментом у доборі умов гідролізу є визначення мінімального гидромодуля для високого гідролізу субстрата.
Постановка експерименту була така: сім колб обсягом в 100 см³ вносили по 10 р гомогената шквары, потім одночасно розчин ферментного препарату і відповідні обсяг води. Після ферменту та води колби закривали і розраховували на 3 години на ультратермостат при 50оС. Результати експерименту оцінювали за рівнем накопичення аминного азоту (див. мал. 6). Як бачимо малюнку 6 для активного гідролізу білків сировини достатній гидромодуль гомогенат / вода = 1/1: 1,5. Подальше зростання змісту води серед збільшення рівня гідролізу не даёт.
Вирішальне значення в ферментативних реакціях має температура: при низьких температурах фермент то, можливо мало активний, а високих температур можуть призвести до інактивації ферменту. Тому, за постановці цього експерименту особливу увагу приділялося підтримці суворого температурного режиму. Експеримент проводився на трьох поверхнях. У 15 колб по 100 см³ вносили 10 р гомогената. Колби поміщали в термостати за температур 20, 30, 40, 50, 60оС. Потім вносили по 3 см³ ферменту і 12 см³ води (відповідно до раніше отриманим даним), щільно закривали і вели до гідроліз протягом 3 годин. По завершені 3 годин з кожної колби відбирали по 10 см³ субстрату і визначали аминный азот за методикою Серенсена. Результати представлені на рис. 7. Як бачимо на див. мал.7 найбільше накопичення аминного азоту, отже, та максимальна ступінь гідролізу спостерігається за нормальної температури 50оС. При температурах 20, 30, 40оС гідроліз, певне, йде не, т. е. ці температури не забезпечують достатньої катализирующей здібності ферментного препарату і вимагають збільшення тривалості процесу гідролізу, що з погляду технологічного процесу дуже невыгодно.
Температура 60оС наводить, очевидно, до часткової інактивації ферменту. Подальше підвищення температури приведе, швидше за все до її повної інактивації ферменту, тому дослідження дії ферментного препарату при високих температурах вище 60оС немає смысла.
Отже, оптимальна температура гідролізу субстрату препаратом з Penicillium wortmannii 2091 дорівнює 50оС.





Подальшим етапом нашої роботи була визначення дозування препарату. Дозування препарату більшою мірою віддзеркалюється в економічному чиннику процесу, оскільки ферментні препарати поки ще мають досить високий вартість. Експеримент проводився за аналогією з попереднім з урахуванням оптимальної температури уведенням різного кількості ферментного препарату. Фермент вносили (по ПА) у кількості 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0 од. (в розрахунку на 10 р гомогената). Після трьох годин гідролізу визначали аминный азот. Результати представлені на рис. 8.
З отриманих у ході експерименту даних можна дійти невтішного висновку доцільність внесення 4,0 од. (по ПА) ферментного препарату в розрахунку на 10 р білкового сырья.
Час гідролізу, необхідне течії реакції, віддзеркалюється в тривалості всього технологічного процесу. Саме з метою визначення мінімального часу гідролізу з максимальним ефектом накопичення аминного азоту поставили наступний експеримент: гомогенат у кількості 40 р, з обраним гидромодулем, поміщали в термостат при 50оС і додавали розчин ферменту в оптимальному кількості. Проби відбирали щогодини з внесення ферменту. Експеримент проводився на трьох повторностях.
Аналізуючи результати можна сказати, перші на п’ять годин йде накопичення аминного азоту, отже, гідроліз не закінчено і це доцільно його продовжувати. Після 6 — 7 годин гідролізу зміна аминного азоту незначно, т. е. процес гідролізу, певне, перебуває в стадії завершения.
Отже, оптимальна тривалість процесу гідролізу входить у 6 часов.
А, щоб будувати висновки про цінності отриманого гідролізу було проведено оцінка отриманого продукту порівнянні з вихідним сырьём (табл. 6).



Таблиця 6.
Характеристика хімічного складу досліджуваних продуктов.
Показник Гомогенат шквары Гидролизат шквары
Щільність, кг/м3 1,005 1,005
рН 7,75 7,40
Сухі речовини, % 8,4 8,4
Жир, % 2,2 2,2
Загальний азот, % 7,25 7,25
Білковий азот водорозчинний, % 2,5 0,91
Аминный азот, мг/г 1,6 11,0
В’язкість 42 4,2

Аналізуючи дані таблиці 6 можна зробити такі висновки: отриманий гидролизат істотно відрізняється як від вихідного продукту. Гидролизат шквары характерний накопиченням великої кількості вільних амінокислот, про що свідчить різке збільшення амінокислот азоту та зниження рН середовища. Як засвідчили наші дослідження, помітні зміни відбулися у фракційному складі білкових компонентів. Через війну гідролізу висота нерастворённого осаду продукту зменшилася вчетверо, майже 4 разу зменшився вміст водорозчинних білків. Нагромадження низькомолекулярних продуктів розпаду білків, певне, причина втрати желирующих властивостей водорастворимой фракції та зниження в’язкості середовища удесятеро раз.
Зниження жиру мало змінилося, т. е. фермент не має липазной активністю. Аналіз властивостей гідролізату дозволив будувати висновки про цінності білкового продукту, отриманих з шквары й можливості використання у виробництві як замінник основного сырья.
М’ясна промисловість має великими резервами збільшення вироблення цінних продуктів харчування. Нині приділяють значну увагу раціонального використання малоцінних продуктів забою і переробки птахи щоб одержати білкових гідролізатів, які знаходять широке застосування як як компонент їжі, а й як дієтичний продукт для лікувального питания.
Харчовий цінність білкових харчових гідролізатів залежить від технології їх виробництва. У світовій практиці широко використовуються процеси кислотного і лужного гідролізу білків. Проте мають ряд недоліків. Так при лужному гідролізі практично цілком руйнується серин, треонин, аргенин, цистеин. Отримані гідролізати мають неприємним смаком. Кислотний гідроліз протікає швидше, і більш специфічно. Ферментативний гідроліз не містить цих недоліків, що дозволяє значно підвищити живильне цінність одержуваних продуктів і має низку переваг. У його застосуванні виключається жорстке вплив на білкові молекули, розпад амінокислот, може бути добір системи ферментів і умов процесу, що дозволяє створити оптимальну технологію переробки різних видів білкового сировини. Шляхом добору ферментів можна домогтися отримання гідролізату без гіркого привкуса.

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧНА ЧАСТЬ.

4.1 Межпредметность — сучасний принцип обучения.

Удосконалення змісту освіти у школі спирається на комплексне використання у навчанні межпредметных зв’язків. Це одна із критеріїв добору, і координації навчального матеріалу програми суміжних предметов.
Межпредметные зв’язку всебічно впливають на процес навчання — від постановки завдань до її і результатів. Їм властиві методологічні, формують (освітні, розвиваючі, виховують) і конструктивні (системотворні) функції в предметної системі навчання. Поліфункціональність межпредметных зв’язків визначає неоднозначність їх понятійної трактування. Найповніша реалізація можливостей межпредметных зв’язків, прояв всіх своїх функцій у єдності досягаються, коли межпредметные зв’язку функціонують у процесі навчання як принцип побудови локальних дидактичних систем [21].
Розгляд межпредметных зв’язків у руслі методологічних основ навчання дозволяє вбачати у реформі них дидактичну форму загальнонаукового принципу системності. Вони вносять системообразующее початок в предметне навчання, забезпечують цілісність процесу навчання, виконуючи у ньому узагальнюючі функції (методологічну, яка формує, конструктивную).
Межпредметные зв’язку сприяють поліпшенню теоретичного і наукового рівня навчання, здійснення сприяє прилученню школярів до системного методу мислення; формують наукове світогляд учнів; забезпечують систему у створенні предметного обучения.
Отже, межпредметные зв’язку є важливий чинник вдосконалення процесу навчання загалом, всіх його уровнях.
З спільності структури навчальних предметів і структури процесу навчання, можна назвати три основних типи межпредметных зв’язків: змістовно — інформаційні, операционно — деятельностные, організаційно — методические.
Межпредметные зв’язку з урахуванням змісту знань можна зарахувати до типу змістовно — інформаційних. Види зв’язків цього различаются:
1. за складом наукових знань (фактологічні, понятійні, теоретические);
2. за знаннями про пізнанні (філософські, историко-научные, семіотичні, логические);
3. за знаннями про ціннісних орієнтаціях (диалектико-материалистические, ідейно-політичні, політико-економічні, естетичні, етичні, правовые).
Зв’язки у засобах навчально-пізнавальної роботи і умінь які у навчанні різним навчальним предметів належать до типу операционно -деятельностных. Види зв’язків даного типа:
1. практичні, що сприяють виробленню в учнів рухових, трудових, конструктивно — технічних, обчислювальних, експериментальних, мовних умений;
2. пізнавальні, які формують загальнонаукові узагальнені вміння мисленнєвої, творчої, навчальної, операционно — пізнавальної, самообразовательной деятельности;
3. ціннісно — ориентационные, необхідні розробки умінь оцінної, комунікативної, художественно-эстетической діяльності, що є велике значення у формуванні світогляду школьника.
Межпредметные зв’язку функціонують у процесі навчання дітей і здійснюються з допомогою методів і організаційних форм. Це дає можливість окреслити вторинний, підлеглий першим двом тип організаційно-методичних зв’язків, мають самостійного значення. Межпредметные зв’язки цієї типу збагачують методи, прийоми і форми організації обучения.
Види зв’язків такого типу различаются:
1. зі способів засвоєння зв’язків у різних видах знань (репродуктивні, пошукові, творческие);
2. за широтою здійснення (межкурсовые, внутрицикловые, межцикловые);
3. за часом здійснення (спадкоємні, супутні, перспективные);
4. за способом взаємозв'язку предметів (односторонні, двосторонні, многосторонние);
5. по стабільності реалізації (епізодичні, постійні, систематические);
6. за рівнем організації навчально-виховного процесу (поурочные, тематичні і др.);
7. за формами роботи учнів та вчителів (індивідуальні, групові, коллективные).
Межпредметные зв’язку реалізуються у різних формах організації навчальної та позаурочної діяльності [9].
Урок межпредметного характеру повинен відповідати певним дидактичні вимогам. Урок подібного типу повинен мати чітко сформульовану учебно-познавательную завдання, на вирішення яку слід залучення знань із інших предметів; забезпечити високу активність учнів щодо застосування знань із інших предметів; утримувати висновки світоглядного характеру, узагальнюючих і які спираються зв’язок, синтез знань із різних предметів, причинно-наслідкових зв’язків, сутність досліджуваних явищ; викликати позитивно ставлюся учнів, порушувати вони інтерес пізнання перетинів поміж знаннями із різних курсів; бути націленим на узагальнення певних розділів навчального матеріалу суміжних навчальних предметів [9,19, 22, 25].

Методичні прийоми здійснення межпредметных зв’язків на уроці [22].
Звичайні методи лікування й прийоми, зорієнтовані встановлення межпредметных зв’язків. Специфічні для межпредметных зв’язків, збагачуючих мотивацію системи методів обучения.
1. Домашні завдання щодо іншим предметам. Включение в виклад вчителя межпредметного матеріалу іншого предмета. Беседа і відтворення знань іншого предмета.4. Застосування наочних посібників, приладів, фрагментів диа- і кинофильмов.5. Постановка проблемних вопросов.6. Рішення кількісних і якісних завдань, кросвордів межпредметного характера.7. Сообщения учням за матеріалами іншого предмета. Фундаментальна обізнаність із підручниками з кільком предметів на уроке. Использование та вироблення комплексних наочних посібників, узагальнюючих навчальний матеріал кількох предметов. Выполнение письмових самостійних робіт, що розробляються і оцінюються вчителями різних предметов. Комплексные завдання, межпредметные тести, диференційовані з предметів групові задания. Введение межпредметных зошитів (виконання завдань зі різним предметів, створені задля рішення загальної навчальної проблемы). Групповая робота вчителів з організації вивчення межпредметных проблем.


4.2 Межпредметные зв’язку під час уроків химии.

Реалізація межпредметных зв’язків хімії коїться з іншими дисциплінами передбачає здійснення комплексного підходу до відбору навчального матеріалу, тобто. залучення теоретичних і емпіричних відомостей з суміжних дисциплін для багатоаспектного висвітлення основних питань шкільного курсу хімії з формування у учнів цілісних і системних знань на уроках. Механізм формування таких знань — межпредметный синтез, результати якого мають стати засобом добування нових знань, основою подальшого пізнання та розвитку особистості учащегося.
Найбільш важливими й перспективними на формування наукового світогляду і мислення школярів, їх екологічного освіти і традиції виховання, формування цілісного сприйняття реальних предметів і явищ є зв’язку хімії з предметами природничо-математичної цикла.
Курс хімії пов’язані з предметами цього циклу (біологією, географією, фізикою, математикою) на різні форми межпредметных зв’язків: попередні, супутні, перспективні, понятійні, фактичні, теоретичні та інших. [23].
Спільними під навчальні предметів хімії і фізики, наприклад, є: система понять про речовині та її будову, що необхідно для засвоєння фундаментальної фізико-хімічної теорії будівлі речовини; система понять про енергію. Хімію, біологію і фізику об'єднує система понять про матерії, формах її руху, і рівнях організації. У процесі здійснення межпредметных зв’язків «біологія — хімія — фізика» учні глибше усвідомлюють спільність й особливо живих і неживих макротіл, універсальність багатьох фізико-хімічних законів і теорій. Але вони розвивається діалектичний метод мислення [9, 18, 21].
Комплексний підхід до відбору навчального матеріалу для реалізації межпредметных зв’язків включает:
1. Аналіз навчального матеріалу курсу хімії для виявлення питань, для багатоаспектного висвітлення котрих необхідне залучити межпредметный материал.
2. Аналіз і відбір матеріалу суміжних дисциплін, зв’язки й з якими вчитель передбачає реалізовувати навчальному процессе.
3. Дозування межпредметного матеріалу, включаемого у зміст уроку та прогнозування гаданих результатів межпредметного синтеза.
У курсі хімії 8 класу переважають попередні та супутні зв’язку, а курсі хімії 9 класу — супутні і перспективні. У зв’язку з цим мети реалізації межпредметных зв’язків різні. Якщо 8 класі найважливіша мета — формування в учнів міцної понятийно-теоретической бази, з урахуванням якої будуватися подальше вивчення курсу, то 9 класі - формування системних знань на уроках, багатоаспектне висвітлення досліджуваного матеріалу і розширення наукового кругозору учащихся.
З огляду на це автори [23] пропонують такі принципи відбору межпредметного матеріалу до уроку:
1. відповідність межпредметного матеріалу спрямованості і специфіці загальноосвітнього учреждения;
2. відповідність межпредметного матеріалу цілям і предметного змісту обучения;
3. спрямованість межпредметных зв’язків влади на рішення доцільних навчальних проблем;
4. використання різних видів межпредметных зв’язків при лідируючому значенні попередніх і супутніх зв’язків у вісім класі і супутніх і найперспективніших о 9-й класі [23].

4.3 Методичні рекомендації щодо реалізації принципів межпредметных зв’язків щодо тим, пов’язаних із поняттями «ферментні препараты».

Вперше у курсі хімії поняття про ферментах як «про речовинах, прискорювальних хімічні реакції, то, можливо представлено щодо теми: «Швидкість хімічної реакції. Чинники, що впливають швидкість хімічної реакції», причому більше повно щодо теми «Каталіз». (9 клас у школах з поглибленим вивченням химии).
Тема уроку: «КАТАЛІЗ». (9 класс).
Методичні рекомендации.
1.В початку уроку проводять розмову з учнями, у якої закріплюються їх знання з пройденого материалу:
-Що таке швидкість хімічної реакції? Наведіть приклади реакцій які протікають миттєво, повільно, дуже замедленно.
-Назвіть умови, які впливають на швидкість хімічної реакции.
-Що таке каталізатор? Які з вивчених вами реакцій протікали у присутності катализатора?
2. Учитель демонструє досвід окислення оксиду сірки (IV) у присутності оксиду заліза (III). Під час проведення досвіду обговорюють яка прискорює роль каталізатора у цій реакції. Учитель роз’яснює, де сутність течії каталітичних реакцій, сутність каталізатора. Підкреслюють, що каталізатори у змозі утворювати з що реагують речовинами дуже активні проміжні з'єднання з малої тривалістю існування (використовує схему). Далі відзначають, що «дія каталізаторів суворо специфічно, у своїй важливо дотримуватися їх хімічну чистоту.
3. Каталитические процеси поширені у житті тварин організмів. Учні відповідають вопросы:
-Наведіть приклади каталізаторів на живу природе.
-Як завжди біологи називають ці вещества?
Зупинимося самісінькому головною функції білків — ферментативної. Усі ферменти перебувають у собі білки, тому біохімічні реакції перебувають під медичним наглядом білків. Термін «фермент» з латини мови перекладається «закваска».
Потім порівняти ферменти й інші каталізатори. Звертають увагу і те що, що це звичайні каталізатори — речовини небелковой, а ферменти — речовини білкової природи; один каталізатор може змінитися швидкість кількох реакцій, а фермент прискорює тільки один реакцію; ферменти ефективно працюють за нормальної температури людського тіла, а за високої температури і тиску руйнуються; ферменти у клітинах розташовуються невипадково, а певному порядку та його дію контролюють гуморальна і нервова системы.
Учні за групами виконують лабораторну роботу «Дія шлункового соку на білки». Кожна група досліджує одна з умов. Результати роботи обговорюються і заносять у таблицу.

Умови дії шлункового соку на белки.

Умови досвіду. Спостереження. Выводы.
Білок і шлунковий сік за нормальної температури 400С. Крахмал і шлунковий сік за нормальної температури 400С. Белок і шлунковий сік при 00С. Белок і варений шлунковий сок. Белок і шлунковий сік з додаванням луги. Завись растворяется. Взвесь остаётся. Взвесь остаётся. Взвесь остаётся. Взвесь залишається. Фермент працює за нормальної температури тела. Фермент діють лише визначений субстрат — белок. Фермент знижує активність при зниженні температуры. Фермент є білком, а білки під час кипіння свертываются. Фермент працює лише за певної кислотності среды.

Потім, з курсу анатомії згадують, які ферменти є у травних соках організму чоловіки й які живильні речовини вони розщеплюють (використовують схему) [18].

Тема уроку: «БІЛКИ». (11 класс).
На початку заняття доцільно порушити питання: Чому багато людей ототожнюють поняття «білок» з визначенням «жизнь»?
Розкриття змісту уроку піде у наступному порядку (схема):
1. Строение і склад білків. Увага учнів звертається на формули деяких білків: пеніцилін — C16H18O4N8, молоко — C1846H3021O576N468S21, гемоглобін — C3022H4816O872N780S8Fe4.
Формується висновок складність білків, про найважливішому значенні їх задля життєдіяльності всього живого на Земле.
Далі вчитель розповідає про амінокислотах, їх класифікації і значении.
2. Структура білків (рівень організації білкової молекули): первинна, вторинна, третинна і четвертичная структура.
3. Классификация білків структурою і функциям:
а, по структурі: — прості складні белки
-глобулярные і фибриллярные белки
б) виконуваних функцій белков.
Найголовнішим функцією білків є ферментативна. Вчення про ферментах виділяють на самостійну науку — энзимологию. Далі вчитель дає класифікацію ферментів. Потім докладніше стає в механізмі дії ферментів. Весь процес дії ферменту можна розділити втричі стадии:
1) розпізнавання ферментом (E) субстрату (P. S) і зв’язування з ним;
2) освіту активного комплексу (ES);
3) відділення продукту (P), що утворився ході ферментативної реакции.
Схема каталітичної реакции:
E+S? ES? E+P
4. Физико-химические властивості білка. Розглядаються властивості денатурації і ренатурации; чинники, здатні викликати денатурацію (фізичні і химические).
5. Химия харчування. Здоровий спосіб життя — передусім збалансоване харчування. Учитель пропонує ознайомитися з речовинами, входять до складу харчових продуктов.
Завдання: «Про що розповість упаковка». Хлопцям пропонується за бажання відібрати кілька упаковок з-під продуктів харчування, які найчастіше вживаються на їжу та що є улюбленими ласощами. Вони мають определить:
1) какие основні біохімічні компоненти входять до складу продукту у якому количестве;
2) какие компоненти продукту ньому є джерелом білків, жирів і углеводов.
Основний корисний компонент їжі - белки.
1. Биологическая цінність білка. Завдання: Визначити біологічну повноцінність білка різних харчових продуктів лимитирующих амінокислот (використовуючи таблицю про аминокислотном складі деяких продуктів харчування). Розрахунок вести по формуле:

Зміст амінокислоти (мг) один р випробуваного белка
АК= ???
Зміст амінокислоти (мг) один р білка по амінокислотною шкале

Де А К — амінокислотний скор.
2. Потребность людини у білках і аминокислотах.
3. Основная белковосодержащая їжа. Сумісність білкового харчування. З огляду на амінокислотний склад (амінокислотний швидкий) різних продуктів, підібрати їх комбінацію, найбільш відповідну потребам нашого організму в незамінних амінокислотах (використовувати таблиці про аминокислотном складі харчових продуктов).
Далі хлопцям пропонується тест, розрахований два рівня знань (перший рівень вміщує «4» бала, а другий — на «5» балів) [29].
Перший рівень. Другий уровень.
Яка роль ферментів в организме? Как утворені назви груп ферментов? Какие функціональні групи входять до складу амінокислот, які властивості вони определяют? Что таке первинна структура белка? Что є вторинна структура белка? Что таке третинна структура белка?7. Опыт: К розчину білка додайте хлорид натрия. Пронаблюдайте і поясніть изменения. Добавьте води до розчинення белка. Сделайте вывод.8. Відомо, що з тривалість життя 70 років, Оновлення білків в організмі відбувається у середньому 200 раз. Припустімо, скільки вже разів сталося відновлення білків у вашій организме.9. Завдання: Відомо, що з дорослої людини необхідно 1,5 р білка на 1 кг маси тіла щодня. Знаючи свою масу, визначте добову норму споживання білка для свого організму. Припустімо, які функції кожної групи ферментов. Приведите приклади відомих вам ферментів, назвіть їх функции. По аналогії з прикладом на дошці, напишіть рівняння реакції отримання трипептида з дипептида (використовуйте формулу цистеина чи серина). Назвіть отриманий трипептид. Могут чи змінитися властивості білка у разі порушення послідовності амінокислотних ланок в лінійної полімерної цепи? Чем відрізняється первинна структура білка від вторичной? Чем відрізняється третинна структура від і вторичной? Опыт:К розчину білка додайте концентрований розчин сульфату міді (II) або інший солі важкого металла. Пронаблюдайте і поясніть изменения. Добавьте води, поясніть явление. В чому полягає сутність гидролиза?9. Припустімо, чи можна харчові білки замінити іншими компонентами раціону (наприклад, жирами і вуглеводами), щоб забезпечити найважливіші процеси в организме?

Підсумовуючи уроку, вчитель повторює, що поняття «життя» і «білок» нерозривно пов’язані. Щоб питанням, що таке життя, треба знати, що таке білки. Наскільки різноманітні білки, настільки складна й багатолика саме життя [15, 23,29].

ВЫВОДЫ.

1. Для осадження препарату протеиназы доцільно застосовувати етанол чи изопропанол.
2. Компонентний склад препарату представлений чотирма фракціями, дві у тому числі протеолитические.
3. З’ясовано температурні оптимуми протеолітичних ферментів — для протеиназы I — 60, а протеиназы II — 400С.
4. Протеиназа I має коллагенолитическим действием.
5. Протеиназа I є дуже термостабильной, инактивируется при 600С протягом 60 часов.
6. Протеиназа I має специфічністю до білків тваринного происхождения.
7.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Антипова Л. В., Глотова І.А., Кочергина Н.І. Мікробні ферментні препарати в обробці вторинної сировини м’ясної промисловості. // Конференція «Біосинтез ферментів мікроорганізмами»: Тез. докл., Москва, 26 — 27 жовтня 1993 р — Москва, 1993. — С. 33.
2. Антипова Л. В., Глотова І.А., Кочергина Н.І., Чурсін В.І., Макарова О. Г. Розробка і спеціальних мікробних препаратів в обробці шкіряного сировини. // Кожевенно-обувная промисловість. — 1994. — № 5 — 8. — С. 25 — 27.
3. Антипова Л. В., Кочергина Н.І. Спеціальні мікробні препарати ферментів в раціональне використання вторинного м’ясного сировини. // Всесоюз. науч. -техн. цук. «Удосконалення технологічних процесів виробництва нових видів харчових продуктів добавок. Використання вторинної сировини харчових ресурсів». — Київ, 1991. — Ч.1. — С. 222.
4. Антипова Л. В., Насонова Л. В. Дослідження можливості отримання білкового концентрату з кератинсодержащего сировини методом мікробної ферментації. // Тез. докл. 2 науч. -практ. цук. «Розробка та впровадження безвідхідних технологій, використання вторинних ресурсів», Кіров, 30 — 31 травня 1989 г. — Кіров, 1989. — С. 80 — 81.
5. Антипова Л. В., Глотова І.А. Основи раціонального використання вторинного коллагенсодержащего сировини м’ясної промисловості. — Воронеж. — 1997. — С. 246.
6. Василевська І.А. Актиномицеты — продуценти біологічно активних речовин. — Киев: Высшая школа. — 1979. — С. 43.
7. Грачова І.М. Технологія ферментних препаратів. — М.: Агропромиздат. — 1987. — С. 391.
8. Детерман Р. Гель-хроматография. — М.: Світ. — 1970. — С. 352.
9. Зверев І. Дз., Максимова В. М. Межпредметные зв’язку у сучасній школі. — М.: Педагогіка. — 1981. — С. 96.
10. Іванов К.А., Шанушкова Л. П., Нарыжная Т. В. Використання шквары для харчових цілей. // М’ясна індустрія СРСР. — 1982. — № 11. — С. 11 — 15.
11. Извекова Г.І. Протеолитические властивості гриба Em. glabra. // Мікробіологія. — 1985. — т. 54. — С. 62 — 65.
12. Каверзиева О. Д. Стандартний метод визначення протеолитической активності для комплексних препаратів протеиназ. // Приклад. біохімія і мікробіологія. — 1971. — т.7. № 2. — С. 225 — 228.
13. Калунянц К. А., Дорохов В. В., Лосякова К. С., Величко Б. А. Спрямований біосинтез ферментів мікроорганізмами. // Праці ВНИИсинтезбелок. М.: 1974. — В.2. — С. 220.
14. Караваєва М.М., Садыкходжаева Н. Г. Одержання высокоустойчивого препарату протеолітичних ферментів гриба Torula thermophila шт. Уз. ПТ при культивуванні в ферментере. // Приклад. біохімія і мікробіологія. — 1985. — Т. XXI. — № 1. — С. 24 — 27.
15. Колычева З. И. Хімія і харчування. // Хімія у шкільництві. — 1997. — № 4. — С. 86 — 88.
16. Кочетов Г. А. Практичне посібник з энзимологии. — М.: Вищу школу. — 1980. — С. 272.
17. Крестьянова І.Н., Васильєва Л.И., Бартошевич Ю. Э., Ахпаров В. Л., Нахапетян Л. А. Изоэлектрическое фокусування препарату протеолітичних ферментів з Streptomyces 771. // Приклад. біохімія і мікробіологія. — 1983. — Т. XIX. — № 2. — С. 217 — 225.
18. Крилова Н. В. Інтеграція як важлива складова процесу. // Хімія у шкільництві. — 1997. — № 1. — С. 21 — 26.
19. Кулагин П. Г. Межпредметные зв’язку у процесі навчання. — М.: Просвітництво. — 1981. — С. 96.
20. Кавренова Г.І., Руденська Т. ЗВ. Афинная хроматографія протеиназ. // Хімія протеолітичних ферментів. Матеріали 2 Всесоюзного симпозіуму по хімії протеолітичних ферментів. — Углич. — 1979. — С. 134.
21. Максимова В. М. Межпредметные зв’язку в навчально-виховному процесі згорання у сучасної школі. — М.: Просвітництво. — 1987. — С. 160.
22. Межпредметные зв’язку в процесі. — М.: Просвітництво. — 1974. — С.
23. Назаренко В. М. Що треба знати про продукти, які ми вживаємо для харчування. // Хімія у шкільництві. — 1997. — № 5. — С. 16 — 25.
24. Насонова Л. В. Біотехнологія отримання протеиназы актиномицета Streptomyces chromogtnis. // Афтореф. дисс. канд. техн. наук. — Воронеж. — 1988. — С. 24.
25. Здійснення межпредметных зв’язків у процесі навчання. — Володимир. — 1984. — С. 136.
26. Расулундзатуву М. З. Біосинтез як дослідження протеолитического комплексу Streptomyces fulvoviricus ВКМАс — 161. // Автор. дисс. канд. техн. наук. — Воронеж. — 1989. — С. 21.
27. Рожанская Т. И., Морголина Н. А., Андрєєва Т. В. Використання ультрафільтрації у процесах очищення протеолітичних ферментів. // Матеріали 2 Всесоюзного симпозіуму по хімії протеолітичних ферментів. — Углич. — 1979. — С. 134.
28. Фрашель Б., Шишкова Э. А. Властивості протеолітичних ферментів, які у культуральної рідини Actinomyces rimous. // Приклад. біохімія і мікробіологія. — 1968. — № 6. — С. 627 — 631.
29. Шаталов М. А. Межпредметные зв’язку у формуванні системних знань. // Хімія у шкільництві. — 1997. — № 5. — С. 26 — 29.
30. Aussein M., Magdel-Din, Abdel-Gawald E.M. Protease and amylase activities of Asp. flawis grown on hudrocarbons and oxygenated hydrocarbous // Biotechnol. And Bioeng. — 1983. — v. 25. — Nr. 12. — p. 3197 — 3199.
31. Knud Aunstrup — Proteinases // Novo Research Institute, Bagsvaerd, Denmark, — 1979. — p. 114.
32. Odibo F.I., Obi S.K. Purification and some properties of a thermostable protease of Jherm. Thal // j. Appl. Microbiol. And Biothehnol. — 1988. — v.3. — p. 327 -332.
33.

70


61


ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой